Wie die meisten anderen Geschlechtshormone kommt auch Testosteron bei beiden Geschlechtern vor. Die Menge und Wirkung unterscheidet sich aber bei Mann und Frau teilweise beträchtlich.
Männer produzieren Testosteron in den Hoden – angeregt vom Luteinisierenden Hormon -, Frauen in den Eierstöcken. Beide stellen Testosteron in geringem Maß auch in der Nebennierenrinde her. Der Grundstoff für Testosteron ist Cholesterol, aus dem auch andere Androgene, Östrogene und Gestagene hergestellt werden.
Bei Männern sorgt Testosteron für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Penis, Hodensack, Geschlechtdrüsen und der sekundären Geschlechtsmerkmale (z.B. Bartwuchs, Körperbehaarung, tiefe Stimme, männlicher Körperbau). Testosteron ist das wichtigste der männlichen Sexualhormone. Es ist ein Androgen, also ein Hormon, dass eine virilisierende (männlich machende) Wirkung hat. Androgene hemmen vermutlich auch die Speicherung von Fett und verbessern die Muskelfunktion.
Neben dieser Wirkung auf die Geschlechtsorgane fördert Testosteron auch Körperbehaarung und Bartwuchs und den Aufbau von Muskeln. Ein hoher Testosteronspiegel wird begleitet von starker Libido und gelegentlich auch von aggressivem Verhalten. Allerdings wird heute nicht mehr Testosteron als alleiniger Auslöser jeglicher Aggression beim Mann verantwortlich gemacht.
Testosteron ist auch die Vorstufe aller Östrogene, der weiblichen Geschlechtshormone. Ein bestimmtes Enzym baut das Testosteron in Östrogene um.